Внутреннее пространство собора разделено на три части - нефы - массивными прямоугольными столбами - пилонами, поддерживающими крестовые своды. Своды собора украшены орнаментальной росписью, выполненной русскими художниками Бушуевым, Негрубовым и Воробьевым. Пилоны и пилястры расписаны под розовый и зеленый мрамор - это прием, который применялся еще в архитектуре Московской Руси.

В течение многих лет собор был музеем славы русского оружия. Здесь хранились трофейные знамена, ключи от городов и крепостей, взятых русскими войсками в Северной войне со шведами, в войне с Турцией в XVIII веке. Сейчас в соборе 50 копий знамен.

Особый интерес представляют картины над карнизом. В 1728 году Трезини передает перечень живописных работ, которые нужно выполнить в соборе. Живописные работы возглавил А.Матвеев. Картины написаны на евангельский сюжет .

В восточной части собора находится иконостас (перегородка с иконами и резными дверями), отделяющая часть храма, где находится престол (алтарь), от помещения для молящихся). Иконостас выполнен группой московских резчиков из липы в 1722-1726 году по проекту и под руководством И.П.Зарудного. Иконостас является одним из непревзойденных образцов русской резьбы. Здесь продолжены традиции московской школы XVIII века. Иконостас состоит из арки и двух боковых крыльев, имеет ширину 30 м, а высоту 20 м. Каждому из трех нефов соборного зала в иконостасе соответствуют врата. Средние, царские врата были сделаны из дерева, но в конце XIX века обветшали, и их заменили бронзовыми, отлитыми по рисунку деревянных. Их вес 10 тонн.

Живопись иконостаса была выполнена под руководством Меркурьева и Артемьева с помощниками. Основная идея живописи - прославление монархии. В левом крыле Богородицав одежде русской царицы, сидящая на троне. Черты лица ее напоминают Екатерину I. Справа - Христос на престоле также в царской одежде с атрибутами царской власти. Под изображением Христа надпись: "Мною цари царствуют, а сильные пишут правду". Многим ликам иконостаса придано портретное сходство с близкими Петра I. Всего на иконостасе 43 иконы.

Перед иконостасом находится кафедра - место, откуда произносились проповеди. До середины XIX века Петропавловский собор был главным кафедральным собором Петербурга. Золоченая деревянная кафедра выполнена по проекту Трезини Н. Крахтаном. Кафедра украшена картинами на евангельский сюжет, основная тема которых - сила слова, сила проповеди. Кафедру украшают скульптуры четырех евангелистов, а также деревянные и позолоченные скульптуры апостолов Петра и Павла.

В проповедях славили царя небесного и земного, и предавали анафеме тех, кто был против царя. В соборе в первое воскресенье Великого поста предавали анафеме отлученных от церкви. Отлученным запрещалось жениться, иметь детей, быть похороненными на общем кладбище. К числу отлученных относились Степан Разин, Емельян Пугачев, Лев Толстой.

Петропавловский собор являлся придворным собором, где на богослужении часто присутствовали члены царской семьи. Поэтому в соборе имеется специальное царское место, украшенной гербом российской империи. Наверху корона - символ власти.

Собор является усыпальницей русских императоров. Обычай хоронить властителей в соборах относится еще к Киевской Руси. До Петра I московских царей хоронили в Архангельском соборе в Кремле. Петр завещал похоронить себя в Петропавловском соборе, и это символично. Этим он хочет показать, что на невских берегах Россия укрепилась навсегда.

В стенах собора похоронены все цари, начиная от ПетраI до Александра III (кроме Петра II, который похоронен в Москве). Сам Петр I и его жена Екатерина I похоронены у южного входа. Их могилы представляют собой небольшие склепы под каменными плитами пола. В эти склепы помещались металлические ковчеги с гробом. Места могил отмечались вделанными в пол мраморными плитами с надписями и позолоченными крестами. В 1866 году над могилами царей и великих князей были поставлены надгробия из белого мрамора с позолоченными украшениями.

Из 32 надгробий выделяются своим художественным исполнением два: надгробие Александра II и его жены Марии Александровны. Они сделаны из ценных пород камня - монолитов зеленой алтайской яшмы и уральского родонита. Установили надгробие в 1906 году в годовщину убийства Александра II, убитого членами террористической организации "Народная воля".

Правительство стремилось канонизировать Александра, заслуги его - это заслуги царя-освободителя, отменившего крепостное право. В его царствование была осуществлена отмена крепостного права, но реформа была половинчатой. Крестьяне были освобождены без земли. Создавая надгробие этого царя, правительство хотело укрепить веру народа в незыблемость и могущество царской власти, уже подорванное ударом первой русской революции 1905 года.

В июле 1998 года в Петропавловский собор были перевезены останки Николая II и членов его семьи.

В 2006 году рядом с захоронением императора Александра III были перезахоронены останки его жены Марии Федоровны, принцессы датской Дагмары. Она после революции успела уехать из России в 1918 году и жила в Дании.